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編號(hào) |
成分 |
規(guī)格 |
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試劑一 |
5×雙酶一管式 RT-PCR Buffer |
200 μL（橘黃蓋） |
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試劑二 |
MMLV-Taq Mix |
75 μL（紅蓋 |
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試劑三 |
超純水 |
1 mL（亮黃蓋） |
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試劑四 |
Everglades病毒 RT-PCR 引物混合液 |
100 μL（白蓋） |
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試劑五 |
Everglades病毒 RT-PCR 陽(yáng)性對(duì)照（1×10E8 /μL） |
50 μL（黃蓋） |
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試劑六 |
使用手冊(cè) |
1 份 |
運(yùn)輸及保存：
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。收到貨后陽(yáng)性對(duì)照需要跟其他成分分開(kāi)放置，因?yàn)槠淙菀孜廴酒渌煞?，造成假?yáng)性。
自備試劑：
樣品 RNA。
Everglades病毒RT-PCR試劑盒
使用方法：
一、樣品 RNA 的制備：
1. 如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用10μL Everglades病毒PCR陽(yáng)性對(duì)照的 1000 倍稀釋液作為制備的陽(yáng)性對(duì)照?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫?duì)照。制備所得成為樣品 RNA。
2. 用自選方法純化 N+2 個(gè)樣品的 RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容?？梢赃x購(gòu)本公司的柱式病毒 RNAout。
二、設(shè)置 RT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系）：
3. 如果有 N+2 個(gè)樣品，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管（額外增加的兩個(gè)管一個(gè)是RT-PCR 陽(yáng)性對(duì)照，另一個(gè)是 RT-PCR 陰性對(duì)照）并按照下表在 PCR 管中加入下列成分：
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成份 |
N+2 個(gè) 樣品管 |
RT-PCR 陰性對(duì)照 |
RT-PCR 陽(yáng)性對(duì)照 |
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5×雙酶一管式RT-PCR Buffer |
各 4 μL |
4 μL |
4 μL |
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Everglades病毒 RT-PCR 引物混合液 |
各 2 μL |
2μL |
2μL |
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N+2 個(gè)制備的 RNA 樣品 |
各 12.5μL |
-- |
-- |
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超純水 |
-- |
12.5μL |
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Everglades病毒 RT-PCR 陽(yáng)性對(duì)照的 1000倍稀釋液 |
-- |
-- |
12.5μL |
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MMLV-Taq Mix |
1.5 μL |
1.5 μL |
1.5 μL |
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過(guò)程 |
溫度 |
時(shí)間 |
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逆轉(zhuǎn)錄 |
42℃ |
30 min |
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預(yù)變性 |
95℃ |
5 min |
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PCR 反應(yīng)（35 個(gè)循環(huán)） |
95℃ |
30 sec |
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58℃ |
30 sec |
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72℃ |
20 sec |
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后延伸 |
72℃ |
7 min |