枯草芽孢桿菌熒光定量PCR試劑盒
產品及特點：
枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），是芽孢桿菌屬的一種。革蘭氏陽性菌， 可形成內生抗逆芽孢，芽孢 0.6-0.9×1.0-1.5 微米，橢圓到柱狀，位于菌體中 央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。生長、繁殖速度較快，菌落表面粗糙不透明， 污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長時，常形成皺醭，是一種需氧菌?？衫?蛋白質、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遺傳學研究中應用廣泛，對此 菌的嘌呤核苷酸的合成途徑與其調節(jié)機制研究較清楚。廣泛分布在土壤及腐敗的 有機物中，易在枯草浸汁中繁殖。有的菌株是α淀粉酶和中性蛋白酶的重要生產 菌；有的菌株具有強烈降解核苷酸的酶系，故常作選育核苷生產菌的親株或制取 5'-核苷酸酶的菌種。因此快速靈敏檢測枯草芽孢桿菌有重要意義。
本產品就是以 探針法熒光定量 PCR 技術為基礎開發(fā)的專門檢測枯草芽孢桿菌的試劑盒。
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經過優(yōu)化，靈敏性高。
3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)枯草芽孢桿菌高度保守區(qū)設計。
5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。
規(guī)格及成分：

編號	成分	規(guī)格
試劑一	2×Probe qPCR MagicMix	500μL（本色蓋）
試劑三	熒光PCR專用模板稀釋液	1mL（黃蓋）
試劑二	枯草芽孢桿菌qPCR引物混合液	100μL（白蓋）
試劑四	枯草芽孢桿菌qPCR探針	50μL（棕色管）
試劑五	枯草芽孢桿菌探針法qPCR陽性對照(1×10E8/μL)	50μL（紅蓋）
	使用手冊	1份

運輸及保存：
低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
自備試劑：
樣品DNA。
使用方法：
一、稀釋標準曲線樣品(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例)：
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原， 本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，用帶芯槍頭， 下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
枯草芽孢桿菌熒光定量PCR試劑盒
二、樣品DNA的制備： 
7. 如果有 N 個樣品，設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性 對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。
三、Probe qPCR反應(20μL體系，在樣品制備室進行)：
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個 用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用 水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模 板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設 置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好 后加）：

成份	N+2個樣品管	PCR陰性對照管	標準曲線樣品管2-7管
2×Probe qPCR MagicMix	10μL	10μL	各10μL
枯草芽孢桿菌qPCR探針	1μL	1μL	各1μL
枯草芽孢桿菌探針法qPCR引物混合液	2μL	2μL	各2μL
N+2個待測DNA模板	7μL	--	--
超純水	--	7μL	--
第7步所得標準曲線樣品稀釋液2-7號	--	--	各7μL2號樣到2號管,3號樣到3號管

11.蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行PCR：

過程	溫度	時間
預變性	95℃	3 min
PCR反應40個循環(huán)	95℃	15 sec
	60℃	1 min(采集FAM通道的熒光信號)

四、數(shù)據(jù)處理：
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。若重復結果 Ct值小于 40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。