產(chǎn)品及特點(diǎn):
1. 即開即用,用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化,靈敏性高。
3. 提供陽性對(duì)照,便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高,引物是根據(jù)榧子高度保守區(qū)設(shè)計(jì),不會(huì)跟其他病毒 DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。
規(guī)格及成分:
編號(hào) |
成分 |
規(guī)格 |
試劑一 |
2×Probe qPCR MagicMix |
500μL(本色蓋) |
試劑三 |
熒光PCR專用模板稀釋液 |
1 mL(黃蓋) |
試劑二 |
榧子qPCR引物混合液 |
100μL(白蓋) |
試劑四 |
榧子qPCR探針 |
50μL(棕色管) |
試劑五 |
榧子探針法qPCR陽性對(duì)照(1×10E8/μL) |
50μL(紅蓋) |
|
使用手冊(cè) |
1 份 |
低溫運(yùn)輸,-20℃保存,保存期限為 12 個(gè)月。
自備試劑:
樣品DNA。
使用方法:
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例):
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照,只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對(duì)照。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液,用帶芯槍頭,下同)。
3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭,在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭,在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。
6. 放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
榧子探針法PCR鑒定試劑盒
二、樣品DNA的制備:
7. 如果有 N 個(gè)樣品,設(shè)置 N+2 個(gè)提取,多出的一個(gè)是 PC(樣品制備陽性對(duì)照),一個(gè)是 NC(樣品制備陰性對(duì)照)。可以用 10μL 陽性對(duì)照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA,本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。
三、Probe qPCR反應(yīng)(20μL體系,在樣品制備室進(jìn)行):
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管,其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照(用水做模板),6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析,并且只做 1 次重復(fù),則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR管,其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照(用水做模板),1 個(gè)用于 PCR 陽性對(duì)照(用第 4 號(hào)管的陽性對(duì)照稀釋液做模板)。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照,并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后加):
成份 |
N+2個(gè)樣品管 |
PCR陰性對(duì)照管 |
標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品管(2-7管) |
2×ProbeqPCRMagicMix |
10μL |
10μL |
各10μL |
榧子qPCR探針 |
1μL |
1μL |
各1μL |
榧子探針法qPCR引物混合液 |
2μL |
2μL |
各2μL |
N+2個(gè)待測(cè)DNA模板 |
7μL |
-- |
-- |
超純水 |
-- |
7μL |
-- |
第7步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液(2-7號(hào)) |
-- |
-- |
各7μL(2號(hào)樣到2號(hào)管,3號(hào)樣到3號(hào)管) |
過程 |
溫度 |
時(shí)間 |
預(yù)變性 |
95℃ |
3 min |
PCR反應(yīng)40個(gè)循環(huán) |
95℃ |
15 sec |
60℃ |
1 min(采集FAM通道的熒光信號(hào)) |
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè),則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct 值為縱軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA濃度的 log 值,再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè),只判斷陽性或陰性,則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng),有典型擴(kuò)增曲線,Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品,如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct值小于 40,擴(kuò)增曲線有明顯起峰,該樣本判斷為陽性,否則為陰性。