傳染性胰臟壞死病病毒RT-PCR試劑盒
產(chǎn)品及特點(diǎn)： 
傳染性脾腎壞死病病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus，ISKNV）會(huì)引起傳染性脾腎壞死病，是以脾、腎壞死為主要病理特征的一種病毒性。病魚嘴張大，呼吸加快，食欲下降，魚體變黑，有時(shí)有抽筋樣顫動(dòng)；頭部充血，口四周和眼出血；脾臟腫大、糜爛和充血，呈紫黑色；腎臟腫大、充血和潰爛；肝臟腫大，有缺血狀、土黃色或有淤血點(diǎn)等癥狀；常見有腹水，腸內(nèi)有時(shí)充滿黃色粘稠物，膽囊腫大；鰓貧血，發(fā)白，伴有寄生蟲或感染出現(xiàn)出血、腐爛等現(xiàn)象。傳染性脾腎壞死病主要流行于我國南方淡水養(yǎng)殖的鱖中，具有很高的死亡率，對(duì)鱖養(yǎng)殖業(yè)造成很大的威脅，嚴(yán)重危害我國鱖養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，因此傳染性脾腎壞死病病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用，為此本公司開發(fā)了簡單快捷的傳染性脾腎壞死病病毒染料法熒光定量 PCR 檢測試劑盒，
1. 一站式，用戶不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對(duì)照。
2. 根據(jù)傳染性胰臟壞死病病毒的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物，具有良好的特異性。
3. 靈敏度可以達(dá)到 1000 拷貝/反應(yīng)。
4. 使用一管式 RT-PCR 技術(shù)，RT 和 PCR 兩步在一個(gè)試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的 RT-PCR。
6. 本產(chǎn)品只能用于科研，不能用于臨床。
規(guī)格及成分：

編號(hào)	成分	規(guī)格
試劑一	5×雙酶一管式 RT-PCR Buffer	200 μL（橘黃蓋）
試劑二	MMLV-Taq Mix	75 μL（紅蓋）
試劑三	超純水	1 mL（亮黃蓋）
試劑四	傳染性胰臟壞死病病毒 RT-PCR 引物混合液	100 μL（白蓋）
試劑五	傳染性胰臟壞死病病毒 RT-PCR 陽性對(duì)照（1×10E8 /μL）	50 μL（黃蓋）
試劑六	使用手冊(cè)	1 份

注：為避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供專一的DNA 片段作為陽性對(duì)照。 
運(yùn)輸及保存：
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。收到貨后陽性對(duì)照需要跟其他成分分開放置，因?yàn)槠淙菀孜廴酒渌煞郑斐杉訇栃浴?br> 自備試劑：
樣品 RNA。
傳染性胰臟壞死病病毒RT-PCR試劑盒
使用方法：
一、樣品 DNA 的制備：
1. 如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用 10μL 傳染性胰臟壞死病病毒 PCR陽性對(duì)照的 1000 倍稀釋液作為制備的陽性對(duì)照。可以用水作為制備的陰性對(duì)照。制備所得成為樣品 RNA。
2. 用自選方法純化 N+2 個(gè)樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。可以選購本公司的柱式病毒 RNAout。
二、設(shè)置RT- PCR 反應(yīng)(20μL 體系)：
3. 如果有 N+2 個(gè)樣品，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管(額外增加的兩個(gè)管一個(gè)是RT-PCR 陽性對(duì)照，另一個(gè)是 RT-PCR 陰性對(duì)照)并按照下表在 PCR 管中加入下列成分：

成份	N+2 個(gè) 樣品管	RT-PCR 陰性對(duì)照	RT-PCR 陽性對(duì)照
5×雙酶一管式RT-PCR Buffer	各 4 μL	4 μL	4 μL
傳染性胰臟壞死病病毒 RT-PCR 引物混合液	各 2 μL	2μL	2μL
N+2 個(gè)制備的 RNA 樣品	各 12.5μL	--	--
超純水	--	12.5μL	--
傳染性胰臟壞死病病毒 RT-PCR 陽性對(duì)照的 1000倍稀釋液	--	--	12.5μL
MMLV-Taq Mix	1.5 μL	1.5 μL	1.5 μL

4.上機(jī)進(jìn)行 RT-PCR，RT-PCR 反應(yīng)參數(shù)為:

過程	溫度	時(shí)間
逆轉(zhuǎn)錄	42℃	30 min
預(yù)變性	95℃	5 min
PCR反應(yīng)35個(gè)循環(huán)	95℃	30 sec
	58℃	30 sec
	72℃	20 sec
延伸	72℃	7 min

三、電泳檢測：
5. 瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增效果。如果陰性對(duì)照有擴(kuò)增產(chǎn)物或陽性對(duì)照無擴(kuò)增產(chǎn)物，則說明實(shí)驗(yàn)失敗，需要分析實(shí)驗(yàn)失敗的原因。只有在陰性對(duì)照沒有擴(kuò)增產(chǎn)物、陽性對(duì)照必須有預(yù)期條帶出現(xiàn)，才有必要分析樣品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如果有預(yù)期片段大小的擴(kuò)增產(chǎn)物則為陽性，如果無則為陰性。