埃可病毒RT-PCR試劑盒
產(chǎn)品及特點：
埃可病毒(ECHO Virus)是一種 RNA 病毒，只對人類有感染性，多發(fā)于夏、秋季，絕大多數(shù)是隱性感染。病毒感染的臨床表現(xiàn)類似于風(fēng)疹，孕季感染雖可累及胎兒，但很少引起畸形，常見的癥狀為上呼吸道感染、發(fā)燒、非化膿性腦膜炎和皮疹，皮疹為斑或麻疹樣皮疹，持續(xù) 1-3 天自然消退。因此靈敏快捷的診斷產(chǎn)品具有重要的意義。本產(chǎn)品根據(jù) PCR 原理開發(fā)，可用于科研領(lǐng)域快速檢測埃可病毒。
它具有下列特點：
1. 一站式，用戶不需要單獨準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對照。
2. 根據(jù)埃可病毒的保守基因序列設(shè)計的引物，具有良好的特異性。
3. 靈敏度可以達到 1000 拷貝/反應(yīng)。
4. 使用一管式 RT-PCR 技術(shù)，RT 和 PCR 兩步在一個試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的 RT-PCR。
6. 本產(chǎn)品只能用于科研，不能用于臨床。
規(guī)格及成分：
|
編號
|
成分
|
規(guī)格
|
|
試劑一
|
5×雙酶一管式 RT-PCR Buffer
|
200 μL(橘黃蓋)
|
|
試劑二
|
MMLV-Taq Mix
|
75 μL(紅蓋)
|
|
試劑三
|
超純水
|
1 mL(亮黃蓋)
|
|
試劑四
|
埃可病毒RT-PCR 引物混合液
|
100 μL(白蓋)
|
|
試劑五
|
埃可病毒 RT-PCR 陽性對照(1×10E8 /μL)
|
50 μL(黃蓋)
|
|
試劑六
|
使用手冊
|
1 份
|
注：為避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供專一的DNA 片段作為陽性對照。
運輸及保存：
低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。收到貨后陽性對照需要跟其他成分分開放置，因為其容易污染其他成分，造成假陽性。
自備試劑：
樣品 RNA。
埃可病毒RT-PCR試劑盒
使用方法：
一、樣品 DNA 的制備：
1. 如果有 N 個樣品，必須設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC(樣品制備陽性對照)，一個是NC(樣品制備陰性對照)。可以用 10μL埃可病毒PCR陽性對照的 1000 倍稀釋液作為制備的陽性對照。可以用水作為制備的陰性對照。制備所得成為樣品 RNA。
2. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。可以選購本公司的柱式病毒 RNAout。
二、設(shè)置RT- PCR 反應(yīng)(20μL 體系)：
3. 如果有 N+2 個樣品，則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管(額外增加的兩個管一個是RT-PCR 陽性對照，另一個是 RT-PCR 陰性對照)并按照下表在 PCR 管中加入下列成分：
|
成份
|
N+2 個
樣品管
|
RT-PCR
陰性對照
|
RT-PCR
陽性對照
|
|
5×雙酶一管式RT-PCR Buffer
|
各 4 μL
|
4 μL
|
4 μL
|
|
埃可病毒 RT-PCR 引物混合液
|
各 2 μL
|
2μL
|
2μL
|
|
N+2 個制備的 RNA 樣品
|
各 12.5μL
|
--
|
--
|
|
超純水
|
--
|
12.5μL
|
--
|
|
埃可病毒 RT-PCR 陽性對照的 1000倍稀釋液
|
--
|
--
|
12.5μL
|
|
MMLV-Taq Mix
|
1.5 μL
|
1.5 μL
|
1.5 μL
|
4.上機進行 RT-PCR，RT-PCR 反應(yīng)參數(shù)為:
|
過程
|
溫度
|
時間
|
|
逆轉(zhuǎn)錄
|
42℃
|
30 min
|
|
預(yù)變性
|
95℃
|
5 min
|
|
PCR反應(yīng)35個循環(huán)
|
95℃
|
30 sec
|
|
58℃
|
30 sec
|
|
72℃
|
20 sec
|
|
延伸
|
72℃
|
7 min
|
三、電泳檢測：
5. 瓊脂糖電泳檢測擴增效果。如果陰性對照有擴增產(chǎn)物或陽性對照無擴增產(chǎn)物，則說明實驗失敗，需要分析實驗失敗的原因。只有在陰性對照沒有擴增產(chǎn)物、陽性對照必須有預(yù)期條帶出現(xiàn)，才有必要分析樣品的實驗結(jié)果，如果有預(yù)期片段大小的擴增產(chǎn)物則為陽性，如果無則為陰性。
