產(chǎn)品特點
2×SYBR qPCR Mix 是專用于染料法實時熒光定量 PCR 的預(yù)混體系，包含熱啟動 Taq DNA Polymerase 、PCR 擴增優(yōu)化的穩(wěn)定劑和增強劑、dNTPs 、SYBR Green I 熒光染料、 Mg2+等，操作簡便，應(yīng)用于基因組 DNA 靶序列和 RNA 反轉(zhuǎn)錄后 cDNA 靶序列的定量檢 測。該試劑盒確保 DNA 或 cDNA 模板的準確定量，適用于各種類型熒光定量 PCR 儀。
它具有下列特點：
1. 高靈敏度：熒光染料 SYBR Green I 可以與所有的雙鏈 DNA 結(jié)合，可以精-確定量 低拷貝模板。
2. 高特異性：獨特的 PCR 緩沖體系與熱啟動酶的組合，有效抑制非特異性的 PCR 擴增。
成分規(guī)格
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產(chǎn)品名稱
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規(guī)格
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2× SYBR qPCR Mix
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1ml/5×1ml
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50×ROX Reference Dye I
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40μl/200μl
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50×ROX Reference Dye II
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40μl/200μl
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-20℃可長期保存12個月
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本產(chǎn)品僅供科研使用 ，不得用于其它用途
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使用方法
（注 意： 以下舉例為常規(guī)qPCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，實際操作中應(yīng)根據(jù)模板、 引物結(jié)構(gòu)和目的片 段大小不同進行相應(yīng)的改進和優(yōu)化）
1. 將DNA模板、引物、2×SYBR qPCR Mix、50×ROX Reference Dye I/II溶解并置于冰上備用。
2. 根據(jù)以下表格配置反應(yīng)體系，總體積為20 μl。
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試劑
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用量
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終濃度
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2 ×SYBR qPCR Mix
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10μl
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1×
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正義引物 (10μM)
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0.5μl
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0.25μM
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反義引物 (10μM)
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0.5μl
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0.25μM
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模板DNA
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xμl
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／
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50× ROX Reference Dye I or II
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0.4μl
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1×
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ddH2O
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Up to 20μl
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／
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（注 意：
a. 通常引物濃度以 0.25 μM 可以得到較好結(jié)果，可以終濃度 0.1-1.0 μM 作為設(shè)定范圍的參 考。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時，可降低引物濃度，由此優(yōu)化 反應(yīng)體系 ；
b. 通常 DNA 模板的量以 10-100 ng 基因組 DNA 或 1-10 ng cDNA 為參照， 因不同物種的 模板中含有的目的基因拷貝數(shù)不同，可對模板進行梯度稀釋， 以確定佳的模板使用量。)
需使用 ROX Reference Dye I 的機型：
ABI Prism5700、7000、7300、7700、7900、7900HT、 7900HT Fast 、Step-One 、Step-One Plus。
需使用 ROX Reference Dye II 的機型：
ABI Prism 7500/7500Fast 、ViiA7, Stratagene MX4000/MX3005P/MX3000P。
不需要使用 ROX 的機型：
Bio-Rad CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4; Cepheid SmartCycler; Eppendorf Mastercycler ep realplex, realplex 2 s; Illumina Eco qPCR; Qiagen/Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000; Roche Applied Science LightCycler 480; Thermo Scientific PikoReal Cycler。
3. qPCR反應(yīng)程序，兩步法PCR：
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過程
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溫度
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時間
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預(yù)變性
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95℃
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3min
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35－40cycles
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變性
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95℃
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15sec
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退火/延伸
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60℃
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10-30sec
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熔解曲線分析，按儀器推薦程序
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注 意：
a. 建議采用兩步法 PCR 反應(yīng)程序，若因使用 Tm 值較低的引物等原因，得不到良好的實驗 結(jié)果時，可嘗試進行三步法 PCR 擴增，退火溫度請以56℃-64℃的范圍作為設(shè)定參考；b. 融解曲線分 析請以所使用的熒光定量 PCR 儀推薦的程序進行設(shè)定。）
4. 反應(yīng)結(jié)束后確認熒光定量PCR的擴增曲線和融解曲線，進行PCR定量制作標準曲線等。
引物設(shè)計原則
1. PCR擴增產(chǎn)物長度： 80～150bp較為合適（可以至300bp）。
2. 引物GC含量：40～60%（45～55%理想）。
3. Tm 值：60～65℃ , 正反引物的Tm值不能相差太大。
4. 引物序列：A 、G 、C 、T 整體分布盡量均勻，不要有部分的GC rich或AT rich（特別 是 3’端）。避開T/C（Polypyrimidine）或A/G（Polypurine）的連續(xù)結(jié)構(gòu)。
5. 3’末端序列：避免GC rich或AT rich。3’端堿基好為G或C。盡量避免3’末端堿基為 T。
6. 互補序列：避免引物二聚體的情況。兩條引物間的3’末端避開有2個堿基以上的互補序列。
