病毒DNA提取試劑盒的應用
背景[1-3]
病毒DNA提取試劑盒采用高效、專一結合核酸的離心吸附柱和緩沖系統，適合從血漿、血清和其它無細胞體液等樣品中分離純化病毒的DNA或者RNA，本試劑盒加入了Carrier RNA，可以從體系中輕松捕獲微量核酸,具有方便快捷、產量高、重復性好的特點。所得病毒基因組DNA或RNA無蛋白、核酸酶或其它雜質的污染，可直接用于PCR、酶切、雜交、反轉錄等分子生物學實驗。

病毒DNA提取試劑盒
產品特點：
快速純化得到高質量病毒DNA和RNA。
無有機抽提或乙醇沉淀。
重復性強，產量高。
完全去除污染物和抑制劑，方便下游應用。

病毒是一類個體微小，結構簡單，只含單一核酸，必須在活細胞內寄生并以復制方式增殖的非細胞型微生物。病毒在自然界分布廣泛，可感染人體細胞，在細胞內解體釋放出核酸分子，借細胞內環境的條件以獨特的生命活動體系進行復制，常引起人體發病。目前知道的DNA病毒有乙肝病毒，T2噬菌體，天花病毒，花椰菜花葉病毒等，病毒DNA提取試劑盒適用于所有的感染人類的血液中的病毒基因組DNA的提取，在已知的DNA病毒中，因為乙肝病毒對人類的影響和危害*大，傳染性*強，因此病毒DNA提取試劑盒尤其適用于乙肝病毒基因組DNA的提取。

實驗步驟：
樣品首先被蛋白酶K消化，隨后加入適合DNA結合到純化柱上的緩沖液，然后加入到純化柱內。通過高速離心，使DNA在穿過純化柱的瞬間，結合到純化柱上，隨后通過兩次洗滌去除各種雜質，*后通過洗脫液把DNA洗脫下來。整個過程無需酚氯仿抽提，無需酒精沉淀，樣品裂解后僅需約15分鐘即可完成。

病毒DNA提取試劑盒的應用
用于核盤菌DNA病毒SsHADV-1的基因功能和入侵機制研究
探討了病毒SsHADV-1的衣殼蛋白Cp和復制相關蛋白Rep在核盤菌中的生物學功能。利用**啟動子PtrpC或EF-1α,獲得了在核盤菌菌株Ep-1PNA367中超量表達Cp和Rep基因的轉化子。兩種類型的轉化子中病毒的Cp和Rep基因可以單獨或共同轉錄,但是均檢測不到病毒蛋白翻譯。陽性轉化子在菌絲**形態、菌落形態、及產酸能力和致病力上均與菌株Ep-1PNA367不存在顯著性差異。

此外,SsHADV-1病毒能通過菌絲融合自攜帶病毒的核盤菌水平傳播至表達Cp和Rep轉化子中,據此推測病毒Cp或Rep在核盤菌中超表達均不能抗病毒。利用SsHADV-1外殼蛋白Cp單克隆抗體對攜帶病毒菌株的總蛋白進行免疫沉淀反應,獲得核盤菌中61個與病毒Cp互作的候選蛋白。

分析了SsHADV-1病毒粒子直接進入核盤菌菌絲的分子機制。通過高通量測序在轉錄水平上分析了病毒粒子侵染菌絲早期（1 h-3 h）的核盤菌差異表達基因,發現在核盤菌菌絲受SsHADV-1病毒粒子侵染后,共有187個基因顯著差異表達,其中114個上調表達,73個下調表達。受病毒粒子侵染的差異表達基因主要參與到生物代謝、***和次級代謝產物合成途徑。

細胞結構分析表明有26%的差異基因與膜結構相關,且10個基因被預測定位于細胞膜上。30%有功能注釋的基因預測參與Ras-small G蛋白信號轉導途徑。因此,推測SsHADV-1病毒粒子在侵染初期可能結合宿主膜蛋白,并在感染過程中通過Ras-small G蛋白偶聯受體進行信號轉導。明確了受病毒SsHADV-1侵染影響的核盤菌基因SS1G06180生物學功能。

利用SsHADV-1病毒粒子直接侵染核盤菌Ep-1PNA367的菌絲,處理3 h時基因SS1G06180顯著下調表達。SS1G06180全長1498 bp,在核盤菌中-功能未知,預測編碼一種蛋白激酶,且含有多個phos-PKC類型磷酸化位點。該假定蛋白在5’端編碼含有Macoilin家族蛋白的跨膜結構,此外含有編碼Pal1的保守結構域,預測定位于細胞核內。

通過病毒水平傳播,證明沉默基因SS1G06180的轉化子具有抗DNA,+ssRNA和dsRNA**病毒的特性,與典型的RNAi和甲基化抗病毒機制不相同。分析沉默基因SS1G06180的轉化子轉錄組測序結果,發現沉默轉化子中酪氨酸和苯丙氨酸代謝、次級代謝產物合成和甘油酯代謝等通路受到影響。野生型核盤菌在PDA上生長第5 d（菌核原基形成）和第9 d（菌核成熟）時,SS1G06180表達量較高。

獲得了敲除SS1G06180的轉化子,其表型為菌落較白,菌核數量減少,單個菌核增大,致病力下降。黑色素與菌核形成相關,在敲除轉化子中黑色素合成信號通路的聚酮合酶基因PKS13明顯下調表達,小柱孢酮脫水酶基因SCD1和還原酶基因T4HN顯著上調表達,推測SS1G06180在核盤菌中參與黑色素合成從而影響菌核發育。前期的研究發現SsHADV-1不能感染灰葡萄孢,但是本研究表明SsHADV-1病毒粒子雖然不能直接侵染灰葡萄孢健康菌絲,但是病毒粒子可以通過PEG介導感染3個不同的灰葡萄孢菌株,且病毒可以在灰葡萄孢菌絲中復制和增殖。

獲得病毒SsHADV-1后的灰葡萄孢菌株B05.10-HADV平均生長速度為11 mm/d,顯著低于不含病毒的灰葡萄孢B05.10（平均生長速度為14 mm/d）。菌株B05.10-HADV菌落異常,其分生孢子攜帶病毒SsHADV-1的概率為1/20。從菌株B05.10-HADV中提取的DNA病毒粒子裂解獲得的病毒核酸與SsHADV-1有一個堿基的差別,在編碼病毒Rep的2086位堿基由C（胞嘧啶）堿基突變為T（胸腺嘧啶）堿基,對應的氨基酸則由蘇氨酸突變為絲氨酸。推測SsHADV-1的Rep區域單堿基突變可能造成了寄主范圍的改變。